8912240182 61 دانشگاه علوم پزشكي گلستان مركز تحقيقات سلولي و مولكولي E-cadherin Expression Rate In Mouse Blastocysts Yielded From In Vitro Fertilization Of Ovulated Mature Oocytes After Ovarian Stimulation Using Recombinant Follicle Stimulating Hormone And Estradiol (E2) ميزان بيان ژن E-cadherin در رويانهاي مرحله بلاستوسيت موش پس از IVF تخمك هاي بالغ حاصل از تحريك تخمدان با استفاده از فاكتور نوتركيبي رشد فوليكول سالهاست در درمان ناباروي كه از ديد سازمان جهاني بهداشت مساله مهمي در بهداشت عمومي محسوب ميشود از تكنيكهاي كمك باروري استفاده مي گردد و در اين راه گام اول بدست آوردن تخمك هايي است با صلاحيت تكاملي براي توليد رويان هاي آماده براي لانه گزيني.
بمنظور نيل به اين هدف در مراكز ناباروري ابتدا تحريك تخمدان Ovarian stimulationبا روشهاي مختلف صورت گرفته و سپس تخمك هاي بدست آمده تحت لقاح در محيط كشت In vitro fertilization (IVF)
قرار مي گيرند. سپس رويانهاي حاصل، بسته به نوع تكنيك در مرحله تكاملي مختلف (دو سلولي،مورولا،بلاستوسيست وغيره)به داخل رحم و يا لوله رحمي منتقل مي شوند. آنچه در اين ميان از اهميت زيادي برخوردار است قابليت رويان براي لانه گزيني در ديواره رحم از طريق بيان مولكولهاي چسباني چون E-cadherin (E-cad.) هم در سلولهاي تروفوبلاست رويان و هم در سلولهاي اندومتر رحم مي باشد، بطوريكه نقص در بيان آن، لانه گزيني را در آن دوره زماني كوتاه ميسر نمي سازد. ژن E-cadherin؛رويانهاي مرحله بلاستوسيست ؛IVF ؛تحريك تخمدان ؛فاكتور نوتركيبي رشد فوليكول؛ استراديول 1300147200 8 با توجه به موارد فوق هدف از اين تحقيق بررسي ميزان بيان ژن E-cad. در رويانهاي مرحله بلاستوسيست موش پس از IVF تخمك هاي بالغ حاصل از تحريك تخمدان با استفاده از Recombinant follicle stimulating hormone (rFSH) به تنهايي و يا در تركيب با) Estradiol (E2 مي باشد. الف) هدف اصلي طرح :
تعيين ميزان بيان ژن .E-cad در رويانهاي مرحله بلاستوسيت موش سوريپس از IVFتخمك هاي بالغ حاصل از تحريك تخمدان با استفاده از rFSH وE2

ب) اهداف فرعي:
1. تعيين ميزان بيان ژن E-cad دررويان هاي مرحله بلاستوسيت موش سوري پس از IVF تخمك هاي بالغ حاصل از تحريك تخمدان با استفاده از rFSH به تنهايي
2. تعيين ميزان بيان ژن . E-cad دررويان هاي مرحله بلاستوسيت موش سوري پس از IVF تخمك هاي بالغ حاصل از تحريك تخمدان با استفاده ازاثر تركيبي rFSH وE2
3. تعيين ميزان تخمك هاي بدست آمده، در صد لقاح و رويان هاي مرحله بلاستوسيست موش سوري پس از IVF تخمك هاي بالغ حاصل از تحريك تخمدان با استفاده ازاثر rFSH به تنهايي
4. تعيين ميزان تخمك هاي بدست آمده،درصد لقاح و رويان هاي مرحله بلاستوسيست موش سوري پس از IVF تخمك هاي بالغ حاصل از تحريك تخمدان با استفاده ازاثر تركيبي rFSH وE2





ج) هدف كاربردي :

با انجام اين مطالعه و پس از تعيين روش موثرتر در تحريك تخمدان و بيان E-cad. بيشتر مي توان نتايج تحقيق را به مراكز درمان ناباروري توصيه نمود تا اين مراكز پس از انجام كارآزمايي هاي باليني مربوطه و تاييد نتايج مثبت، آن را بعنوان يك روش كارآمد مورد استفاده قرار دهند. در اين تحقيق از موش هاي سوري بالغ نژاد NMRI استفاده مي شود كه از موسسه پاستور (تهران- ايران) خريداري خواهند شد. پس از ورود به مدت يك هفته نگهداري شده تا با شرايط حيوان خانه كه شامل حرارت 23-21 درجه سانتي گراد وشرايط نوري 12 ساعت روشنايي- 12ساعت تاريكي بوده ، سازگار شوند. ضمن اينكه آب و غذا نيز به اندازه كافي در اختيار آنها قرار داده مي شود.
از موش هاي ماده بالغ جهت گرفتن مجموعه هاي كومولوس-تخمك استفاده خواهد شد و موش هاي نربالغ جهت تهيه اسپرم براي انجام عمل لقاح در محيط كشت بكار خواهند آمد.
براي انجام اين تحقيق از2 گروه 20 تايي موش هاي ماده استفاده مي شود(44)كه شامل:
v گروه تجربي (1 ) كه rFSH (Gonal-f; Serono, Swiss) به ميزان 10 واحد تك دوز به ازاي هر موش و بصورت IP دريافت مي كند (44 ).
v گروه تجربي (2) كه مشابه گروه تجربي(1)rFSH و نيز (Aburayhan, Iran) Estradiol valerate بميزان µg/mouse20 به صورت IP و تك دوز دريافت خواهد كرد(45).
48 ساعت قبل از انجام IVF ، هورمونhCG (Choriman; IBSA, Swiss)
به ميزان IU/ml10 ، به صورت IP به موش ها تزريق مي شود و پس از طي اين مدت كه با القاي تخمك گذاري همراه است، مجموعه هاي تخمك- كومولوس (Cumulus-oocyte complexes , COCs) از لوله رحمي به منظور انجام IVF جمع آوري شده وبه قطره هايي از محيط كشت KSOM حاوي Bovine Serum Albumin (BSA) منتقل مي شوند و براي انجام لقاح در انكوباتور نگه داري مي شود.

IVF

اسپرم ها گرفته شده از اپيديديم موش نر بالغ پس از كشتن حيوان از طريق در رفتگي مهره هاي گردني، به انكوباتور مرطوب با شرايط 37 درجه سانتي گراد و 5 درصد CO2 منتقل شده تا ظرفيت گيري اسپرم ها انجام گيرد. سپس اسپرم هاي فعال و ظرفيت گيري شده به قطره هاي حاوي محيط كشت لقاح (Fertilization medium) كه متشكل از T6 و BSA بوده، منتقل مي شود.
COCsبه فاصله كوتاهي قبل از انجام IVF، با هيالورونيداز تيمار مي شوند تا سلولهاي كومولوس اضافي برداشته شود.
COCs حاصل از گروههاي تعريف شده به طور جداگانه به قطره هاي مربوطه حاوي اسپرم، منتقل مي شود تا عمل لقاح در انكوباتور با شرايط فوق صورت گيرد.
پس از 6-4 ساعت تخمك هاي بارور شده از محيط فوق خارج شده و به قطره ها يي حاوي KSOM منتقل مي شوند(45،18)
سپس رويانهاي مرحله بلاستوسيست در ساعت 120 پس از لقاح در زير ميكروسكوپ معكوس جمع آوري و براي استخراج RNA وارد مرحله بعدي مي شوند.

تعيين ميزان بيان ژن مربوط به .E-cad در رويان هاي مرحله بلاستوسيت موش با استفاده از RT-PCR :

1- استخراج mRNA :Total mRNA از بلاستوسيت ها با استفاده از RNAeasy mini kit (50)
GERMANY) (QIAGEN; بر طبق دستور العمل كيت استخراج مي شود.


2- نسخه برداري معكوس: ساختcDNA با استفاده از mRNA حاصل ، بوسيله
Reverse Transcriptase Kit (QIAGEN; GERMANY) Sensiscript
بر طبق دستور العمل مربوطه انجام مي گيرد.


3- :Real time PCR در اين مرحله، به منظور نرماليزاسيون، از پرايمرهاي S18 RNA براي تمام گروهها استفاده مي شود تا بيان ژن مربوط به E-cad.نسبت به آن با استفاده از دستگاهReal time PCR (ABI; USA) و با استفاده از كيت SYBR® Green PCR Core Reagents (Applied Biosystems) تعيين گردد. 101214000 دانشگاه علوم پزشكي گلستان 1300147200 0 بلي بلي فعال و منتشر شده 1309910400